RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50μM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5μg/mL, 5,0μg/mL ou 10,0μg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.

ABSTRACT This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50μM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5μg/mL, 5.0μg/mL or 10.0μg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.

RESUMO O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50μM/mL Cisteamina; T3) 2,5μg/mL; T4) 5,0μg/mL e T5) 10,0μg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50μM/mL Cysteamine; T3)2.5μg/mL; T4)5.0μg/mL and T5)10.0μg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.

RESUMO O Brasil atualmente é detentor do terceiro maior rebanho de vacas leiteiras do mundo, composto, em sua maioria, de animais mestiços F1 (Gir X Holandês), os quais são bem adaptados às áreas tropicais. O objetivo do presente estudo foi investigar a eficiência da ovum pick-up (OPU) e da produção in vitro de embriões oriundos de doadoras Girolando com sêmen sexado de touros provenientes de duas raças, Gir e Holandesa. Foram utilizados dados referentes a 232 animais de diversos rebanhos, totalizando 4334 oócitos recuperados. Os oócitos foram classificados, e as estruturas viáveis (GI, GII e GIII) foram utilizadas para produção in vitro de embriões (PIVE). Foi observada uma média de oócitos recuperados para as doadoras F1 de 18,14±1,33. Além disso, notou-se que não houve diferença entre os dois cruzamentos utilizados, considerando média de total de embriões (4,96±0,40 e 6,56±0,76) para o cruzamento F1 X HPB (Holandês preto e branco) e F1 X Gir, respectivamente. Portanto, as doadoras F1 apresentaram potencial como doadoras de oócitos no sistema de produção in vitro de embriões, independentemente da raça do touro cujo sêmen foi utilizado.

ABSTRACT Brazil currently has the third largest herd of dairy cattle in the world, composed mainly by F1 crossbreed animals (Gyr x Holstein), which are well adapted to tropical areas. The aim of this study was to evaluate the efficiency of Girolando donors in OPU and in vitro production of embryos (IVEP) using sexed semen of bulls from two breeds, Gyr and Holstein. We used data from 232 animals coming from different herds and the total of recovered oocytes was 4334. The oocytes were classified according to their viability and the viable ones (GI, GII and GIII) were used for IVP. The average of oocyte recovery from F1 donors was 18.14±1.33. There was no difference on the average of embryos considering the crossing F1 X Holstein (4.96±0.40) and F1 X Gyr (6.56±0.76). In conclusion, F1 donors showed a potential for being oocyte donors in the system of in vitro production of embryos, regardless the breed of the bull.

Avaliou-se o efeito do soro de cadela em estro na maturação in vitro de ovócitos caninos, utilizando-se 92 ovócitos de cadelas, submetidas à cirurgia eletiva de ovarioisterectomia. Os ovócitos foram selecionados e distribuídos em dois tratamentos: T1 (n = 48), ovócitos cultivados in vitro durante 96 horas utilizando meio base - TCM199 + 5µg/mL de LH + 20µg/mL de FSH - mais 10% de soro inativado de vaca em estro e T2 (n = 44), ovócitos cultivados em meio base mais 10% de soro inativado de cadela em estro. O percentual de ovócitos observados em metáfase I não indicou diferenças (P>0,05) entre T1 (2,1%) e T2 (0,0%), porém a taxa de ovócitos maduros (metáfase II) foi diferente (P<0,05), sendo 27,1% em T1 e 47,7% em T2. O mesmo fato ocorreu com a taxa de cromatina condensada (P<0,01), com 14,6 e 0,0%, respectivamente. Nos ovócitos sem configuração cromossômica, não foram observadas diferenças (P>0,05), sendo 56,3% em T1 e 52,3% em T2. Estes resultados indicam que a adição de soro de cadela em estro no meio de cultivo oferece melhores condições para o desenvolvimento in vitro, quando comparado à de soro de vaca em estro.

This study aimed to evaluate the effect of estrus on in vitro canine oocyte. A total of 92 oocyte from bitches under ovary-hysterectomy surgery was used. The oocytes were selected and randomly assigned to two different treatments, being T1 (n = 48) in vitro cultured for 96h using basic medium (TCM199 + 5µg/mL of LH + 20µg/mL of FSH), plus 10% of cow inactive serum in estrus and T2 (n = 44) basic medium plus 10% of bitch inactive serum in estrus. The percentage of oocyte observed on metaphase I do not indicate a difference (P>0.05) between T1 (2.1%) and T2 (0.0%). However, the rate of mature oocyte (metaphase II) was different (P<0.05), being 27.1% for T1 and 47.7% for T2. There was difference (P<0.05) in the condensed chromatin rate for T1 (14.6 %) and T2 (0.0 %), respectively. There was no difference (P>0.05) between T1 (56.3%) and T2 (52.3%) in oocyte with no chromosome configuration. These results indicate that supplementation with estrus bitch serum on culture media offer better conditions to in vitro development, when compared to estrus cow serum.

Avaliou-se a eficácia de duas soluções de manipulação (SM) de embriões de camundongas nos estádios de blastocisto inicial (Bin), mórula compacta grau I (McI) e II (McII), distribuídos aleatoriamente em três tratamentos (T), de acordo com a solução de manutenção. No T1 usou-se PBS modificado (controle); no T2, SME e no T3, SME enriquecida. Os embriões foram mantidos durante quatro horas na solução de manutenção e posteriormente classificados quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. Logo após, foram cultivados em meio TCM 199 e classificados novamente quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. A taxa de desenvolvimento dos embriões após manutenção por quatro horas em solução de manipulação foi menor (P<0,05) nos embriões do controle, comparada à de embriões do SME e SME enriquecida, diferença esta não observada (P>0,05) após o cultivo in vitro. Os embriões McII do T3 tiveram maior desenvolvimento (P<0,05) em relação aos embriões do T1 e T2, indicando o efeito benéfico do enriquecimento da solução SME. Conclui-se que as soluções de manipulação SME e SME enriquecida influenciaram beneficamente o desenvolvimento de embriões

The effect of embryo manipulation solution followed by in vitro culture in mice embryos was studied. The embryos at early blastocyst (Bin), and compact morula grades I (McI) and II (McII) were randomly assigned into three treatments. T1 used modified PBS (control), T2 used EMS, and T3 used EMS supplemented. In each treatment, the embryos were kept in manipulation solution for four hours. Finishing the manipulation period, the embryos were classified according the development stage and quality. Following, the embryos were cultured in TCM 199. After the culture period, the embryos were evaluated according to quality and development stage. The development rate for Bin, McI, and McII after maintenance for four hours in manipulation solution was lower for control embryo (P>0.05) as compared to EMS and EMS supplemented embryos. After in vitro culture, no differences (P>0.05) on embryo development rate among control, EMS, and EMS supplemented were observed. Moreover, McII from EMS supplemented had a higher development (P<0.05) (93%) as compared to control (82.5%) and EMS (83.9%), suggesting a beneficial effect of EMS supplemented. EMS and EMS supplemented embryos had a positive effect on embryo development, showing higher embryo development than those in PBS solution

A simplified, fast, and innovative method was developed to count the total cell number in blastocysts. Murine blastocysts (N = 195) were used in this study. They were obtained after 10h culture of initial blastocysts, compact morulae grades I and II recovered from superovulated mouse. After culture, the blastococysts were selected to test the new proposal of counting. The process was done after embryo fixation in a sodium citrate solution, and adherence in glass slide. Following, the coloration was done using a fast panoptic coloration kit. As a result, it was possible to identify the blastomeres and count them in each blastocyst. This method provided a fast and effective analysis of the total cell number when compared with other techniques. Moreover, this new method shows advantages related to the cell visualization, which can be done in more simple equipment like stereoscopic microscope. Other interesting observed point was the long period of time and quality that the coloration stays on slides, considering other techniques.